Tujuan

Menentukan dan memahami prosedur lanjut mengenai aktivitas antibakteri ekstrak etilasetat daun sirih hijau terhadap bakteri S. epidermis.

Landasan Teori

Indonesia adalah salah satu negara berkembang dengan iklim tropis dan memiliki keberagaman yang cukup besar sehingga memiliki keberagaman yang cukup besar sehingga memiliki sumber bahan baku obat khususnya obat tradisional yang temurun. Pemanfaatan tumbuhan sebagai obat merupakan warisan nenek moyang yang sejak dahulu kala dan telah banyak digunakan dalam kurung waktu yang cukup lama hampir di seluruh dunia. Pengembangan produksi tanaman obat semakin pesat, dipengaruhi oleh kesadaran masyarakat yang meningkat tentang manfaat tanaman obat. Penelitian tentang bahan alam sendiri sudah banyak diteliti di indonesia. Hal ini terkait dengan kandungan bahan aktif sebagai hasil metabolisme sekunder pada tanaman yang dapat memberikan banyak manfaat (Dima, L., Fatimawati, & Lolo, W,. A., 2016).

Sirih merupakan tanaman dengan keluarga piperaceae, tumbuhan yang hidup merambat pada pohon lain dengan ketinggian mencapai 5-15 meter. Tanaman sirih adalah tanaman perdu dengan batang berkayu, berbuku buku serta bersalur. Daun sirih hijau (Piper betle L.) mempunyai kandungan senyawa kimia diantaranya yaitu minyak atsirin, saponin, polifenol, alkoloid dan flavonoid yang dapat dimanfaatkan sebagai antibakteri. Komponen utama daun sirih adalah minyak atsiri, yang berisi fenol dan turunannya seperti betelfenol (kavibetol) dan kavikol. Pada daun sirih hijau terkandung senyawa seperti, hidroksi kavikol, hidroksikavikol asetat, alipiroketekol, kavibetol, piperbetol, metil piperbetol, piperol A dan piperol B (Syahida, D., R., 2019).

Daun sirih juga diketahui mempunyai aktivitas antibakteri pada berbagai macam bakteri dengan spektrum luas diantaranya yaitu E.coli, Staphylococcus aereus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Streptococcus pyrogen, dan bakteri yang hidup pada saluran kencing seperti Klebsiella pnemoniae, C.koseri, Enterococcus faecalis, C fruendi. Syeikh et al., (2012) menyatakan bahwa penggunaan ekstrak tumbuhan yang memiliki aktivitas antimikroba sangat membantu dalam penyembuhan.

Molekul bioaktif yang bertanggung jawab untuk aktivitas anti bakteri adalah sterol, yang dapat diperoleh dalam jumlah yang besar dari ekstrak daun sirih. Mekanisme kerja sterol dalam melawan bakteri yaitu dengan adanya interaksi sterol dengan membran sel bakteri dan dinding sel sehingga menyebabkan perubahan pada struktur utama dinding sel dan akhirnya terjadi degradasi pada komponen bakteri. Selain itu sterol juga dapat mengganggu permeabilitas dari membran sel dari bakteri.

Penggunaan daun sirih hijau (Piper betle L.) sebagai antibakteri disebabkan karena terdapat minyak atsiri diantaranya adalah fenol dan kavikol (jumlah lebih besar). Kavikol merupakan derivat dari fenol yang akan memberikan bau yang khas pada Piper betle L. serta mempunyai daya bakterisida yang lebih kuat daripada turunan fenol yang lain (Syahida, D., R., 2019). Komponen minyak atsiri daun sirih Hijau sebagai berikut :

Jerawat adalah penyakit yang banyak diderita masyarakat terutama remaja. Penyakit ini dapat disebabkan oleh antibakteri yaitu P.acnes dan bakteri S.epidermidis. Bakteri ini merupakan flora normal di kulit, namun dapat bersifat inovatif. Penyebab lain adanya zat nutrisi bagi bakteri yang diproduksi dari sekresi kelenjar sebasea yakni air, asam amino, urea, garam dan asam lemak. Jerawat yang disebabkan oleh beberapa bakteri seperti P.acnes, s.aereus dan S.epidermis menimbulkan efek yang berbeda-beda. P.acnes menghasilkan lipase yang memecah asam lemak bebas dari lipid kulit yang akan menyebabkan terjadinya inflasi jaringan sehingga mendukung terbentuknya acne. S.aereus menyebabkan infeksi termasuk jerawat yang menghasilkan nanah. Sedangkan apabila S.epidermis berkembang pada kelenjar sebaceous dan tersumbat, akan menghasilkan zat- zat yang akan menyebabkan iritasi pada daerah sekitarnya selanjutnya akan membengkak, pecah dan kemudian menyebarkan radang ke jaringan kulit (Datta A., Ghoshdastidar, S., & Singh, M. 2011).

Berdasarkan penelitian-penelitian yang ada mengenai pengujian terhadap bakteri, sehingga penelitian ini dilakukan untuk melihat aktivitas antibakteri ekstrak etilasetat dari daun sirih hijau terhadap bakteri S.epidermis.

Alat & Bahan

Alat:

• Autoklaf Bejana maserasi
• Cawan petri
• Erlenmeyer
• Gelas kimia
• Inkubator
• Jangka sorong
• Jarum ose
• Laminar Air Flow (LAF)
• Lampu bunsen
• Mikro pipet
• Tabung reaksi
• Oven
• Pinset
• Swab
• Neraca analitik
• Waterbath

Bahan:

• Aquades steril
• Bakteri uji S. epidermidis
• Daun sirih hijau
• Etil asetat
• Etanol 70%
• FeCl3 1%
• HCl 2N, dan pekat
• H2SO4
• Larutan HgCl2 dan KI
• Larutan Bi(NO3)3.H2O, HNO3, KI
• Larutan HNO3 dan KI
• Larutan asam asetat anhidrat dan kloroform
• Media Nutient Agar (NA)
• NaCl 0,9%
• Paper disc tetrasiklin 30 𝜇𝑔
• Paper disc blank
• Serbuk Mg
• NaOH 20%

Cara Kerja

Pembuatan Simplisia

1. Daun sirih hijau disortasi
2. Daun dicuci kemudian ditiriskan
3. Daun dipotong kecil Dikeringkan pada temperatuur 50-600C selama 3-5 hari
4. Daun disortasi kering

Ekstraksi

1. Simplisa ditimbang 300 g
2. Dimaserasi dengan etil asetat 2,25 L, diaduk, dan ditutup rapat
3. Diaduk 3 kali sehari. Maserasi 3×24 jam, jauhkan dari cahaya
4. Setelah 3 hari, campuran disaring, filtrat dipisahkan
5. Ampas dimaserasi dengan cara yang sama
6. Filtrat dikumpulkan dan dipekatkan dengan rotavapor

Skrining Fitokimia

Uji Saponin

1. 0,1 g ekstrak etilasetat dimasukan ke tabung reaksi
2. Ditambah 10 mL air hangat atau panas lalu dikocok 30 menit
3. Busa yang terbentuk diukur
4. Dibiarkan 5 menit. Jika busa tidak hilang, ditambah HCl 2 N

Uji Flavonoid

1. 0,1 g ekstrak etilasetat dimasukkan ke tabung reaksi
2. Ditambahkan 0,5 mg serbuk Mg dan HCl pekat 3 tetes

Uji Alkaloid

1. 0,1 g ekstrak etil asetat dimasukkan ke tabung reaksi
2. Ditambah 2 mL kloroform dan 2 mL ammonia, dikocok
3. Ditambah HCl 2 N Larutan dibagi menjadi 3 tabung
4. Tabung 1 + pereaksi Dragendorf; Tabung 2 + Pereaksi Mayer; Tabung 3 + Pereaksi Wagner

Uji Tanin

1. 0,1 g ekstrak etil asetat dimasukkan ke tabung reaksi
2. Ditambah 3 tetes FeCl₃

atau

1. 0,5 g ekstrak etil asetat dimasukkan ke tabung reaksi
2. Ditambah KOH 10 mL

Uji Flavonoid

1. 0,1 g ekstrak etil asetat dimasukkan ke tabung reaksi
2. Ditambahkan aseton, kemudian diuapkan
3. Resude diekstraksi menggunakan air panas
4. Filtrat didinginkan
5. Ditambah 5 mL NaOH 20%

Uji Steroid

1. 0,1 g ekstrak etil asetat dimasukkan ke tabung reaksi
2. Ditambahkan 2 mL H₂SO₄ Pekat

Sterilisasi Alat

Sterilisasi alat dengan menggunakan metode panas kering dan panas lembab sedangkan sterilisasi medium dilakukan panas lembab

Peremajaan Kultur Murni Bakteri Uji

1. 1 koloni biakan murni S.epidermidis diambil menggunakan ose steril
2. Diinokulasi dalam medium NA miring
3. Diinkubasi dalam incubator pada 37⁰C selama 1×24 Jam

Pembuatan Suspensi Larutan Uji

Hasil peremajaan bakteri S.epidermidis disuspensikan dengan NaCl 0,9%, yang setara dengan Mc. Farland 0,5 (10⁸ koloni/mL).

Penyiapan Sampel

1. Ekstrak daun sirih hijau ditimbang 0,1, 0,3, 0,5 g
2. Dilarutkan dalam DMSO hingga 10 mL

Pengujian Sampel Terhadap Bakteri Uji

1. 15 mL NA dimasukkan ke cawan petri
2. 1 ose bakteri (108 kol/mL) dimasukkan cawan petri dan digores merata
3. Dimasukkan 3 jenis paper disc yang telah ditetesi 20 μL larutan
4. Jarak paper disc 2-3 cm di pinggir cawan petri
5. Diinkubasi pada 37⁰C selama 1×24 jam
6. Diameter bening yang terbentuk diukur menggunakan jangka sorong
7. Diulangni 3 kali

Macam-macam paper disc:

Paper disc ekstrak etil asetat

Paper disc tetrasiklin sebagai kontrol positif

Paper disc etil asetat sebagai kontrol negatif

Data Pengamatan

Tabel Hasil Data Pengukuran Daya Hambat Ekstrak Daun Sirih S.epidermidis

Pembahasan

Tujuan dari percobaan ini yaitu untuk menemukan dan memahami prosedur mengenai uji aktivitas antibakteri senyawa bahan alam. Bahan alam yang digunakan dalam percobaan ini yaitu ekstrak etil asetat pada daun sirih. Daun sirih di Indonesia sangat banyak ditemukan dan banyak dikenal sebagai bahan obat tradisional. Seperti halnya dengan antibiotika, daun sirih juga mempunyai daya antibakteri. Kemampuan tersebut karena adanya berbagai zat yang terkandung di dalamnya seperti kandungan minyak atsiri. Simplisia dari daun sirih disiapkan dengan memotong daun sirih kecil-kecil kemudian dikeringkan pada temperatur 50-60°C selama 3-5 hari.

Kemudian simplisia diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut etil asetat. Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (kamar). Metode maserasi ini digunakan untuk mengekstrak jaringan tanaman yang belum diketahui kandungan senyawanya yang kemungkinan bersifat tidak tahan panas sehingga kerusakan komponen tersebut dapat dihindari. Proses yang terjadi selama ekstraksi adalah pemisahan senyawa-senyawa dalam simplisia keluar dari simplisia dan melarutnya kandungan senyawa kimia oleh pelarut keluar dari sel tanaman melalui proses difusi dengan 3 tahapan

yaitu: masuknya pelarut ke dalam sel tanaman sehingga terjadi pengembangan (swelling) sel tanaman. Pada tahap kedua adalah proses disolusi yaitu melarutnya kandungan senyawa dalam pelarut, Isi sel akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan di luar sel. Tahap ketiga adalah difusi dari senyawa tanaman, keluar dari sel tanaman (simplisia), larutan yang konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh pelarut dengan konsentrasi rendah (Novita, 2016).

Proses ekstraksi ekstrak etil asetat daun sirih hijau menghasilkan rendemen sebesar 3,1% dari 300 g simplisia yang diekstraksi. Kemudian dilakukan skrining fitokimia untuk mengidentifikasi adanya senyawa kimia pada daun sirih seperti uji flavonoid, alkaloid, fenolik, steroid, saponin, dan tanin. Hasil menunjukkan ekstrak etil asetat mengandung uji positif terhadap tanin dan fenolik sedangkan alkaloid, steroid, saponin menunjukkan hasil negatif. Faktor penggunaan pelarut juga dapat berpengaruh terhadap hasil metabolit sekunder yang didapat. Golongan terpenoid/steroid merupakan senyawa yang larut dalam pelarut nonpolar seperti nheksan, sedangkan senyawa flavonoid dan tanin dapat larut dalam pelarut polar seperti metanol, etanol, etil asetat atau pelarut polar lainnya, dan golongan alkaloid termasuk senyawa yang tidak larut dalam air.

Tanin merupakan poliflavanoid yang biasanya digunakan sebagai bahan penyegar, mempunyai sifat antimikroba terhadap khamir, bakteri dan kapang. Kemampuan tanin sebagai bahan antimikroba diduga karena tanin akan berikatan dengan dinding sel bakteri, sehingga akan menginaktifkan kemampuan menempel bakteri, menghambat pertumbuhan, aktivitas enzim protease dan dapat membentuk ikatan kompleks dengan polisakarida (Nuraini, 2007). Tanin juga merupakan senyawa metabolit sekunder pada tanaman yang bersifat sebagai antibakteri, memiliki kemampuan menyamak kulit dan juga dikenal sebagai adstrigensia (Sitorus, 2018). Sedangkan senyawa fenol memiliki mekanisme dalam agen antibakteri dengan berperan sebagai toksin dalam protoplasma, merusak dan menembus dinding serta mengendapkan protein sel bakteri (Carolia & Noventi, 2016).

Bakteri uji yang digunakan pada percobaan ini adalah S.epidermis biakan murni atau ATCC (American Type Culture Collection), bukan bakteri uji yang berasal dari lingkungan ataupun pasien. Hal tersebut dikarenakan bakteri ATCC merupakan bakteri standar yang disarankan untuk digunakan sebagai bakteri uji dalam penelitian. Selain itu, bakteri biakan murni ATCC tidak mudah terkontaminasi. Bakteri yang berasal dari lingkungan ataupun pasien sangat rentan terkontaminasi, sehingga dalam penelitian digunakan bakteri uji ATCC (Utomo et al., 2018) . Peremajaan bakteri dilakukan dengan cara menanam bakteri S. epidermidis ke dalam cawan petri yang berisi media NA. Isolat bakteri kemudian distreak pada medium yang telah tersedia, dilakukan di dalam LAF untuk menghindari terjadinya kontaminasi. Peremajaan bakteri bertujuan agar bakteri memulai metabolisme kembali setelah penyiapan. Peremajaan bakteri dilakukan dengan mengambil satu jarum ose biakan murni kemudian digoreskan dalam biakan agar dengan permukaan miring, kemudian diinkubasi pada suhu 37⁰C selama 24 jam. Setelah proses peremajaan bakteri selesai, bakteri siap digunakan dengan proses inokulasi. Proses inokulasi dilakukan

dengan mengambil satu jarum oase suspensi bahan yang mengandung bakteri dari medium agar miring, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam sambil diaduk.

Uji aktivitas antibakteri ekstrak etil asetat daun sirih dilakukan dengan menggunakan metode difusi agar. Metode difusi agar didasarkan pada difusi agen antibakteri pada agar yang diinokulasi mikroorganisme. Dalam percobaan ini, metode yang digunakan adalah difusi disk/cakram dengan variasi konsentrasi yang digunakan adalah 1%, 3%, dan 5%. Kontrol negatif yang digunakan adalah cairan penyari dari sampel uji, sedangkan kontrol positifnya adalah tetrasiklin. Tetrasiklin merupakan antibiotik yang mengganggu proses sintesis protein, antibiotik yang mampu menghambat bakteri baik Gram positif maupun Gram negatif. Kontrol negatif yang digunakan dalam penelitian ini adalah DMSO. Natheer et al (2012) menyebutkan bahwa zat yang digunakan sebagai kontrol negatif adalah pelarut yang digunakan sebagai pengencer dari senyawa yang akan diuji. Dalam penelitian ini pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel adalah DMSO. Sehingga kontrol negatif yang digunakan adalah DMSO. Tujuannya adalah sebagai pembanding bahwa pelarut yang digunakan sebagai pengencer tidak mempengaruhi hasil uji antibakteri dari senyawa yang akan diuji.

Pemilihan metode ini didasarkan karena metode difusi merupakan metode yang cepat, mudah dan sederhana dalam pengerjaannya. Disk yang berisi senyawa antibakteri diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih pada permukaan media agar mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh senyawa antibakteri. Uji antibakteri dilakukan dalam kondisi steril baik dari media yang digunakan, peralatan uji, maupun ruang yang digunakan untuk uji, hal tersebut dilakukan untuk menghindari kontaminasi. Bakteri uji yang digunakan adalah S.epidermidis. Media yang digunakan untuk uji zona hambat adalah media Nutrient Agar (NA) dalam cawan petri. Media NA adalah media universal yang berwarna coklat muda, memiliki konsistensi yang padat dimana media ini berasal dari sintetik dan memiliki kegunaan sebagai media menumbuhkan bakteri.

Uji aktivitas antibakteri ekstrak etil asetat daun sirih dengan variasi konsentrasi 1%, 3% dan 5% menghasilkan kontrol positif tetrasiklin, hal tersebut menunjukkan adanya aktivitas penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri S.epidermidis yang ditandai dengan terbentuknya zona hambat disekitar paper dics. Rata-rata zona hambat ekstrak etil asetat daun sirih terhadap bakteri S.epidermidis yaitu berkisar antara 0 mm; 9,8 mm; dan 15 mm. Sedangkan untuk kontrol negatif 0 mm dan kontrol positif 27mm dalam pelarut etil asetat. Hasil diameter hambat ekstrak tersebut termasuk kategori sedang-kuat sedangkan kontrol positif kategori sangat kuat. Daya antibakteri berdasarkan diameter zona hambat terbagi sangat kuat (lebih dari 20 mm), kuat (zona hambat 10-20 mm), sedang (zona hambat 5-10 mm) dan lemah (zona hambat kurang dari 5 mm) (Safitri et al, 2017). Hasil zona hambat kontrol negatif terhadap S. epidermis adalah 0 mm menunjukkan bahwa penggunaan pelarut DMSO tidak mempengaruhi hasil uji antibakteri.

Simpulan

Ekstrak Etil Asetat Daun Sirih Hijau (Piper betle L.) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Bakteri Staphylococcus epidermidis. Bakteri uji yang digunakan adalah S.epidermis biakan murni atau ATCC (American Type Culture Collection) karena bakteri ATCC merupakan bakteri standar yang disarankan untuk digunakan sebagai bakteri uji dalam penelitian. Hasil skrining fitokimia menunjukkan ekstrak etil asetat mengandung uji positif terhadap tanin dan fenolik sedangkan alkaloid, steroid, saponin menunjukkan hasil negatif. Ekstrak etil asetat dapat menghambat bakteri S.epidermidis pada konsentrasi 3% dan 5% memiliki daya hambat sebesar 9,8 mm dan 15 mm (kategori sedang dan kuat). Sedangkan untuk kontrol negatif 0 mm dan kontrol positif 27mm dalam pelarut etil asetat. Hasil zona hambat kontrol negatif terhadap S. epidermis adalah 0 mm menunjukkan bahwa penggunaan pelarut DMSO tidak mempengaruhi hasil uji antibakteri.

Daftar Pustaka

Carolia, N & Noventi, W. (2016). Potensi Ekstrak Daun Sirih Hijau (Piper Betle L) Sebagai Alternatif Terapi Acne Vulgaris. Medical Journal of Lampung University, 5 (1), 140-145.

Datta, A., Ghoshdastidar, S., & Singh, M. 2011. AntimicrobialProperty of Piper betel Leaf against Clinical Isolates of Bacteria, International Journal of Pharma Sciences and Research vol 01.2(3). 104-109.

Dima, L., Fatimawati, & Lolo, W,. A. 2016. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Kelor (Moringa oleifera L.) Terhadap Bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Jurnal Ilmiah Farmasi, vol 5 (2). 283-288.

Novita, W. (2016). Uji aktivitas Antibakteri Fraksi Daun Sirih (Piper Betle L) Terhadap Pertumbuhan Bakteri Streptococcus Mutans Secara In Vitro. Jambi Medical Journal, 4 (2). 140-155.

Nuraini, A. D. (2007). Ekstraksi Komponen Antibakteri dan Antioksidan dari Biji Teratai (Nymphaea pubescens Willd). Bogor: Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor.

Natheer, S. E., Sekar, C., Amutharaj, P., Rahman, M. S. A., & Khan, K. F. (2012). Evaluation of antibacterial activity of Morinda citrifolia, Vitex trifolia and Chromolaena odorata. African journal of pharmacy and pharmacology, 6(11), 783-788.

Safitri, L.G., Wibowo, M.A., Idiawati, N. (2017). Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kasar Buah Asam Paya (Eleiodoxa conferta (Griff.) Buret) Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus Dan Salmonella thypi. Jurnal Kimia Khatulistiwa, 6 (1), 17-20.

Sheikh, M., Abdullah R.M., Meghavanshi, & Irshad, M. 2012. Studies on Some Plant Extract for Their Antimicrobial Potential Against Certain Pathogenic Microorganisms. American Journal of Plant Sciences. 3. 209-213.

Sitorus, P. (2018). Uji Efek Kombinasi Amoksisilin Dengan Ekstrak Etanol Daun Sirih (Piper Betle L) Terhadap Pertumbuhan Bakteri Escherichia Coli Dan Staphylococcus Aureus. Tropical Medicine Conference Series, 1 (1), 313-319.

Syahida, D., R. 2019. Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi Etil Asetat Daun Sirih Hijau (Piper betle

L.) Terhadap Pertumbuhan Bakteri Staphylococcus aereus Secara Vitro. Skripsi.

Utomo, S. B., Fujiyanti, M., Lestari, W. P., & Mulyani, S. (2018). Uji Aktivitas Antibakteri Senyawa C-4 Metoksifenilkaliks [4] Resorsinarena Termodifikasi Hexadecyltrimethylammonium-Bromide Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus Dan Escherichia coli. Jurnal Kimia dan Pendidikan Kimia, 3(3), 109-209.