Pengertian dan Prinsip Dasar
Spektrofotometri merupakan suatu metode yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu larutan berwarna pada panjang geombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detector. Spektrofotometer merupakan alat yang terdiri dari spectrometer dan fotometer. Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjanga gelombang. Spectrometer dapat menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjdang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang di transmisikan atau di absorbsi. Ada beberapa jenis spektrofotometri yang sering digunakan dalam analisis secara kimiawi, yaitu spketrofotometri VIS, spektrofotometri UVdan spektrofotometri UV-VIS. (Khopkar, 1990).
Spektrofotometri UV-VIS ini merupakan gabungan antara spektrofotomtri UV dan visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan cahaya visible. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mat akita maka senyawa yang dapat diserap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna, bening dan transaparan.
Analisis kuantitatif dapat diketahui dengan menggunakan spektrofootometri UV- VIS. Penentuan panjang gelombang maksimum yang digunakan dalam pngukuran absorbansi maksimum konsentrasi larutan standar. Ketelitian kemapuan cara ini tergantung paa ketetapan pemilihan panjang gelombang yang sesaui denganmemberikan perbedaan kontras pada masing -masing absorbansi dan pemilihan factor koreksi terhadap konsentrasi komponen asing yang tidak terukur (Sumarauw, dkk. 2013).
Konsentrasi larutan yang dianalisis sebanding dengan jumlah sinar yang diserap oleh zat yang terdapat dalam larutan yang dianalisis sebanding dengan jumlah sinar yang diserap oleh zat yang terdapat dalam larutan tersebut. Dalam hal ini, hukum lamber beer dapat menyatkan hubungan antara serapan cahaya dengan konsentrasi zat dalam larutan. Di bawah ini adalah persamaan lamber beer:
A = -log T = ε. B. c
Dimana
A = absorben
T = transmiton
Ε = absorvitas molar (L cm-4. Mol-1
C = panjang sel (cm)
B = konsentrasi zat (mol/jam
Prinsip keja spektrofotometer adalah bila cahaya (monokromik maupun campuran) jatuh pada suatu medium homogen, Sebagian dari sinar masuk akan dipantulkan, Sebagian diserap dalam medium itu, dan sisanya diteruskan. Nilai yang keluar dari cahaya yang diteruskan dinyataan dalam nilai absorbansi karena memilki hubungan dengan konsentrasi sampel. Prinsip kerja dari spektrofotometer dapat digambarkan sebagai berikut:
Komponen-Komponen spektrofotometer UV-Vis
Komponen-komponen peralatan spektrofotometer UV-Vis dijelaskan secara garis besar sebagai berikut:
1. Sumber cahaya
Sumber cahaya pada spektrofotometer harus memilki pancaran yang stabil dan intensifikasinya tinggi. Sebagai sumber radiasi UV digunakan lampu deuterium (D). sedangkan sumber radiasi tampak yang juga menghasilkan sinar infra merah (IR) dekat menggunakan lampu filament tungsten yang dapat menghasilkan tenaga radiasi 350-3500 nm
2. Monomakrometer
Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya polikromatis menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu (monokromatis) yang berbeda (terdispersi) ada dua macam monokromator yaitu prisma dan erating (kisi difraksi). Monokromator berfungsi untuk mengurai sinar tersebut menjadi monokromatis sesuai yang diinginkan.
3. Cuvet
Cuvet adalah suatu alat yang dipakai sebagai tempat cuplikan atau senyawa yang aakn diteliti. Cuvet harus memnuhi syarat-syarat sebagai berikut: (1) tidak berwarna, (2) permukannya secara optis harus benar-benar standar, (3) tahan terhadpat bahan-bahan kimia (tidak berekasi), (4) tidak boleh rapuh, (5) mempunyai bentuk yang sederhana.
4. Detector
Detector memiliki peranan yaitu memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang. Detector akan mengubah Chaya menjadi sinyal listrik yang selanjutknya akan ditunjukan oleh angka digital.
5. Amplifier
Amplifier memilki fungsi untuk mmeperbesar arus yang dihasilkan oleh detector agar dapat dibca indicator yang biasanya berupa recorder analog atau komputer.
Cara Kalibrasi Spektrofotometer UV-Vis
Kalibrasi yang dimaksud ini adalah menseting blank alat spektrofotometer, sebelum digunakan untuk analisis.
- Dihidupkan alat spektrofotometer, ditunggu sampe keluar angka dan diamkan 30 menit sebelum digunakan.
- Kuvet diisi dengan larutan blanko (aquades).
- Diseting/diatur panjang gelombang untuk kalibrasi. Keterangan: 0% itu diukur saat kuvet dalam keadaan kosong. 100% T itu diukur saat kuvet dalam keadaan terisi larutan.
- Kuvet berisi larutan blanko dimasukan ke spektrofotometer
- Lalu tekan tombol 0 ABS 100%T, tunggu sampai keluar kondisi setting blank (dalam bentuk teks).
Matching Cuvet
Matching cuvet dilakukan untuk mengetahui apakah kuvet yang digunakan mempunyai diameter (nilai b) yang sama. Hal ini perlu dilakukan, karena menurut hukum Lambert-Beer, nilai A berbanding lurus dengan nilai b dan C (konsentrasi larutan).
- Di siapkan 4 kuvet, salah satu diisi larutan blanko (aquades), kuvet yang lain diisi larutan CoCl2 (larutan berwarna pink) untuk matching kuvet.
- Diletakan blanko kedalam alat, ditekan) ABS 100% T. Keterangan: 0% T diukur saat kuvet dalam keadaan kosong dan 100% T diukur saat kuvet dalam keadaan terisi larutan).
- Kemudian, ditunggu sampai keluar “setting-blank” (dalam bentuk teks).
- Selanjutnya, larutan blanko dikeluarkan, diganti dengan larutan CoCl2 dimasukan ke dalam alat dan dicatat nilai absorbansinya
- Diulangi percobaan dengan memasukan larutan blanko kembali dan diganti dengan kuvet yang berisi larutan CoCl2 yang lain, dan seterusnya dan dicatat nilai absorbansinya.
