Pendahuluan
Vitamin adalah suatu zat senyawa kompleks yang sangat dibutuhkan oleh tubuh kita yang berfungsi untuk mambantu pengaturan atau proses kegiatan tubuh. Tanpa vitamin manusia, hewan dan makhluk hidup lainnya tidak akan dapat melakukan aktifitas hidup dan kekurangan vitamin dapat menyebabkan memperbesar peluang terkena penyakit pada tubuh kita.
Vitamin memiliki peranan spesifik di dalam tubuh dan dapat pula memberikan manfaat kesehatan. Bila kadar senyawa ini tidak mencukupi, tubuh dapat mengalami suatu penyakit. Tubuh hanya memerlukan vitamin dalam jumlah sedikit, tetapi jika kebutuhan ini diabaikan maka metabolism di dalam tubuh kita akan terganggu karena fungsinya tidak dapat digantikan oleh senyawa lain. Gangguan kesehatan ini dikenal dengan istilah avitaminosis. Di samping itu, asupan vitamin juga tidak boleh berlebihan karena dapat menyebabkan gangguan metabolisme pada tubuh.
Dalam penentuan apakah makanan itu mengandung vitamin apa tidak, diperlukan suatu pengujian agar dapat mengetahui kadar vitamin tersebut. Dengan mengetahui kadar vitamin yang ada dalam bahan pangan, maka kita dapat mengetahui kadar vitamin yang diperlukan oleh tubuh kita agar tidak terjadi kekurangan vitamin yang dapat mengganggu kesehatan tubuh kita.
Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif vitamin A adalah salah satu metode yang digunakan untuk mengidentifikasi keberadaan vitamin A dalam suatu sampel. Vitamin A atau retinol adalah vitamin larut lemak yang penting untuk kesehatan mata, kulit, dan sistem kekebalan tubuh. Berikut langkah-langkah analisis kualitatif vitamin A menggunakan larutan kloroform, asam asetat anhidrid, dan larutan SbCl3. Metode ini juga dapat digunakan untuk membedakan vitamin A dari senyawa-senyawa lain yang memiliki kelompok ikatan rangkap.
- Persiapan sampel: Sampel yang akan dianalisis harus diambil dalam jumlah yang cukup dan ditempatkan dalam tabung reaksi bersih dan kering. Jika sampel berupa makanan atau minuman, maka perlu diambil ekstraknya terlebih dahulu.
- Penambahan pelarut: Tambahkan larutan kloroform dan beberapa tetes asam asetat anhidrid ke dalam tabung reaksi yang berisi sampel. Pastikan rasio pelarut dan sampel cukup untuk melarutkan vitamin A.
- Pengocokan: Guncangkan tabung reaksi secara perlahan selama beberapa menit hingga sampel terlarut sempurna dalam pelarut.
- Pemisahan: Setelah sampel tercampur dengan baik, biarkan tabung reaksi dalam keadaan diam agar lapisan-lapisan dapat terbentuk. Vitamin A yang terlarut dalam kloroform akan berada di lapisan bawah.
- Pengambilan lapisan: Setelah lapisan terbentuk, gunakan pipet atau saringan kertas untuk mengambil lapisan kloroform yang mengandung vitamin A. Kemudian, letakkan lapisan tersebut pada plat gelas yang bersih dan kering.
- Penambahan larutan SbCl3: Teteskan sedikit larutan SbCl3 pada noda atau bercak kuning yang terbentuk pada plat gelas. Larutan SbCl3 berperan sebagai pengoksidasi untuk mengoksidasi vitamin A menjadi senyawa yang lebih reaktif.
- Pengamatan: Setelah penambahan larutan SbCl3, noda atau bercak kuning yang terbentuk akan berubah menjadi kristal berwarna ungu kebiruan atau ungu kehitaman. Warna ini menunjukkan adanya vitamin A dalam sampel.
Dalam analisis kualitatif vitamin A dengan larutan kloroform, asam asetat anhidrid, dan larutan SbCl3, larutan SbCl3 berperan sebagai pengoksidasi untuk mengoksidasi vitamin A menjadi senyawa yang lebih reaktif. Selanjutnya, asam asetat anhidrid berperan sebagai reduktor untuk mereduksi senyawa yang terbentuk menjadi senyawa yang berwarna ungu kebiruan atau ungu kehitaman. Larutan kloroform berperan sebagai pelarut untuk melarutkan vitamin A dari sampel. Dengan menggunakan ketiga larutan tersebut, analisis kualitatif vitamin A menjadi lebih spesifik dan sensitif. Namun, metode ini juga tidak memberikan informasi tentang jumlah vitamin A yang terkandung dalam sampel, sehingga perlu dilakukan analisis kuantitatif untuk mengetahui konsentrasi vitamin A dengan lebih akurat.
Analisis Kuantitatif
1. Metode Spektrofotometri
Spektrum absorbsi ultraviolet vitamin A dan vitamin A secara asetat mempunyai absorbansi maksimal pada panjang gelombang antara 325 sampai 328 nm dalam berbagai pelarut. Larutan vitamin a dalam isopropanol absorbansinya diukur pada λmaks dan pada dua titik, yakni satu disebelah kanan λmaks dan satunya lagi pada sebelah kiri λmaks. Absorbansi pada λmaks dikoreksi terhadap senyawa penggangu dengan menggunakan formula koreksi karena senyawa-senyawa ini akan ikut menyerap pada daerah UV. Beberapa penggangu, terutama pada minyak ikan adalah vitamin A2, kitol, anhidro vitamin A, dan asma polien. Pada vitamin A sintetik senyawa penganggu adalah senyawa-senyawa antar ( intermediet). Dengan demikian senyawa penganggu ada vitamin A sintetik dengan minyak ikan yang berbeda.
Penetapan dilakukan secepat mugkin, terlindung dari cahaya, dan terlindung dari senyawa oksidator. Sebelum dilakukan penetapan kadar, skala spektrofotometer diperiksa terlebih dahulu. Sebagai pedoman dapat digunakan garis raksa pada 313,16 nm dan 334,5 nm serta garis hidrogen pada 379,7 nm dan 486,1 nm. Ketepatan absorbansi yang telah dikoreksi lebih rendah jika dibandingkan dengan absorbanasi yang diamati langsung dan digunakan dalma perhitungan. Karena itu pengukuran absorbansi membutuhkan perhatian khusus dan sekurang-kurangnya harus dilakukan dua kali penetapan.
Akseroftol dalam bentuk ester
Zat yang tidak larut dalam sikloheksan dimurnikan dengan cara penyaringan atau cara lain yang tidak menggunakan cara penyabunan. Jika cara pemurnian tersebut tidak dilakukan, maka penetapan dilakukan menurut cara yang tertera dalam akseforol lain. Cara penetapan akseroftol murni adalah sebagai berikut: Sejumlah sampel atau sampel yang sudah dimurnikan ditimbang secara saksama lalu dilarutkan dalam sikloheksan secukupnya hingga diperoleh larutan yang mengandung antara 9 SI sampai 15 SI tiap mL dan ditetapkan panjang gelombang maksimalnya. Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang yang tertera dalam daftar berikut dan dihitung sebagai absorbansi relatif terhadap absorbansi pada λ 328 nm.
Jika panjang gelombang absorbansi maksimal terletak antara 326 nm dan 329 nm, tetapai absorbansi relatif yang terbaca lebih besar dari 0,002 dari harga yang tertera dalam daftar, maka dihitung absorbansi pada 328 nm yang dikoreksi dengan rumus:
A328 nm (kor) = 3,52(2A 328 nm – A316 nm – A340 nm)
Jika harga absorbansi yang telah dikoreksi, [A328 nm (kor)] terletak dalam batas ± 3 % dan harga absorbansi yang belum dikoreksi maka perhitungan dilakukan dengan menggunakan harga absorbansi yang belum dikoreksi.
Jika harga absorbansi yang telah dikoreksi terletak antara 85% sampai 97% dari harga yang belum dikoreksi, maka perhitungan dilakukan dengan menggunakan harga absorbansi yang belum dikoreksi.
Jika harga absorbansi yang telah dikoreksi terletak lebih kecil dari 85% dan lebih besar daari 103% dari harga yang belum dikoreksi atu jika panjang gelombang absorbansi maksimal tidak terletak antara 326 nm sampai 329 nm, maka penetapan kadar dilakukan menurut cara yang tertera pada akseroftol lain.
Akseroftol lain
Cara penentuan afseroftol lain: sejumlah zat yang ditimbang secara saksama (mengandung tidak kurang dari 500 SI akseroftol dan tidak lebih dari 1 gram lemak), dicampur dengan 30 ml etanol mutlak dan m mL kalium hidroksida 50 %. Absorbansi larutan diukur pada λ 300 nm, 310 nm, 325 nm dan 334 nm. Selanjutnya dilakukan penentuan panjang gelombang maksimal. Perhitungan potensi dilakukan sebagai berikut:
Jika panjang gelombang maksimal terletak antar 323 nm dan 327 nm dan perbandingan absorbansi pada 300 nm terhadap absorbansi pada 327 nm tidak lebih dari 0,73, maka absorbanasi yang telah dikoreksi [A325 nm(kor)] dihitung dengan rumus:
A325 nm (kor) = 6, 815 A325 nm – 2,555 A310 nm – 4,26 A334 nm
Potensi dalam SI tiap zat yang diperiksa dihitung dengan rumus:
A325 nm (kor) x 18.000
Jika absorbansi yang telah dikoreksi terletak dalam batas ± 3 % dari harga absorbansi yang belum dikoreksi, perhitungan dilakukan dengan menggunakan harga absorbansi yang belum dikoreksi.
Jika panjang gelombang absorbansi maksimal tidak terletak antara 325 nm dan 327 nm atau jika perbandinganabsorbansi pada 300 nm terhadap absorbansi pada 327 nm lebih dari 0,73, maka yang tidak tersabunkan dari zat yang diperiksa harus dimurnikan dengan cara kromatorafi.
2. Metode Kolorimetri
Metode Carr-price
Metode ini berdasarkan atas reaksi akseroftol dengan antimon triklorida anhidrat dalam kloroform yang menghasilkan warna biru. Reaksi ini terjadi antar antimon triklorid dengan rantai tidak jenuh dari akseroftol. Karoten, asam poliena dan beberapa senyawa dalam minyak ikan mengahasilkan warna biru juga. Warna yang terjadi intensitasnya cepat maksimun tetapi juga cepat pucat.
Pengubahan akseroftol menjadi anhidroakseroftol
Akseroftol mudah diubah menjadi anhidroakseroftol dengan bantuan sejumlah kecil asam mineral atau asam organik kuat. Pada metode Budowski dan bondi, akseroftol diubah menjadi anhidroakseroftol dalam pelarut benzen dengan katalisator asam toluen –p-sulfonat pada temperatur kamar. Kenaikan absorbansi pada 399nm merupakan hasil dehidrasi yang berbanding langsung dengan jumlah akseroftol yang terkandung.pengukuran absorbansi pada 358 nm, 377 nm, dan 399 nm dalam benzen merupakan cara yang baik untuk mengetahui kemurnian akseroftol yakni dengan melihat bahwa A 399 nm/ A377 nm sebesar 0,868 dan A 358 nm / A 377 nm sebesar 0,692.
3. Metode Kromatografi
Aktivis isomer vitamin A cukup berbeda sehingga untuk pemisahannya dikembangkan dengan kolom mikrobore. Sampel (1,0- 10,0 gram) dihomogenkan. Sebanyak 30 mL air ditambahkan ke dalam sampel (jika sampelnya padat). Saponifikasi dilakukan dengan mencampur 40 mL sampel yang telah dihomogenkan dengan 12 mL larutan KOH 60%; 80 mL etanol mutlak; 0,5 mL terbutilhidroksi toluen- etanolik 1%; dan 0,5 gram asam askorbat untuk menghindari terjadinya oksidasi. Sampel diaduk pada suhu kamar selama 16 jam. Setelah selesai saponifikasi, solut diencerkan samapi 250 mL dengan air etanol untuk memperoleh suatu rasio etanol:air (1:1 v/v). Sebanyak 20 mL aliquot ditambahkan ke dalam cartidge Kiselguhr dan setelah 20 menit diekstraksi dengan 50 mL petroleumeter ringan. Eluat selanjutnya diuapkan dan dilarutkan kembali dengan 2-50 mL isooktana (tergantung pada konsentrasi Vitamin A dalam sampel mula-mula). Isomer gometri retinol (vitamin A)dipisahkan dengan kolom pengaman ( 7 x 2 mm i.d) dan kolom analisis (100x 2mm i.d) yang keduanya berisi silika ggel dengan ukuran partikel 3 mikron. Sebagai eluen adalah heksan yang mengandung 1-oktanol dalam konsentrasi rendah. Karena panjang gelombang absorbsi maksimun isomer-isomer ini berbeda maka digunakan detektor photodiode array(PAD). Metode ini telah sukses memisahkan 7 isomer vitamin A yakni: 11- cis; 11,13-di-cis: 13-cis;9,13-di-cis; 9-cis ;7-cis; dan semua trans-retinol dengan waktu retensi relatif terhadap trans-retinol masing-masing sebesar 0,510; 0,568; 0,672; 0,740; 0,877;0,924; dan 1,000.
