Laporan Praktikum: Penentuan Kadar Protein Secara Spektrofotometri & Sifat Asam Basa Asam Amino

Tujuan

1. Memahami penggunaan spektrofotometri sebagai alat untuk menganalisis kadar protein dari telur
2. Menjelaskan prinsip dasar penggunaan spektrofotometri dalam analisis kadar protein dari telur
3. Terampil menggunakan spektrofotometri untuk menentukan kadar protein telur

Dasar teori

Protein merupakan makromolekul terbanyak yang dapat ditemui dalam sel hidup, yang merupakan komponen penting dan utama untuk sel hewan dan sel manusia. Protein dapat diisolasi dari seluruh sel ke bagian sel. Dalam hal ini, protein mempunyai peranan penting, sebagai zat pembentuk, transport, katalisator reaksi kimia, hormon, racun, dan yang lainya. Protein ini mempunyai empat fungsi utamanya yaitu memperbaiki jaringan yang rusak untuk pertumbuhan jaringan baru, sebagai enzim, dan sebagai hormone (Mandle, 2012).

Protein juga merupakan persenyawaan kompleks yang dihasilkan dari polimerisasi asam asam amino yang terikat satu sama lain melalui ikatan peptide (-CO-NH-). Protein merupakan senyawa yang sangat penting dalam sistem kehidupan karena protein memainkan peran yang sangat vital dalam semua aktivitas sel-sel tubuh makhluk hidup. Protein digunakan untuk dukungan struktural, penyimpanan, transport substansi lain, pergerakan dan pertahanan melawan substansi asing. Sebagai contoh, fibrosa mempunyai peran yang sangat penting dalam menyangga atau melindungi tubuh, sedangkan protein globuler seperti albumin memiliki peranan dalam aliran darah untuk penahan tekanan osmosis.

Berdasarkan elemen penyusunnya, terbagi menjadi dua yaitu protein sederhana, yaitu protein yang apabila terhirolisis sempurna menghasilkan α-asam amino saja dan protein majemuk, yaitu protein yang mengandung gugus non protein atau prostetik di dalamnya. Asam amino yang terdapat pada protein adalah asam amino karboksilat. Variasi dalam struktur monomer-monomer ini terjadi dalam rantai samping. Asam amino tidak selalu bersifat seperti senyawa organik. Titik leleh diatas 200°C, sedangkan kebanyakan senyawa organik dengan bobot molekul sekitar itu berupa cairan pada temperature kamar, asam amino larut dalam pelarut air dan organik, tetapi tiak larut dalam pelarut nonpolar. Asam amino memiliki momen dipole yang besar, juga mereka bersifat kurang asam dibandingkan sebagian besar asam karboksilat dan kurang basa dibandingkan sebagian besar senyawa amina yang lain (Fessenden, 1989).

Dalam hubunganya dengan asam amino, protein merupakan polimer dari sekitar asam amino yang berlainan disambungkan dengan ikatan peptida, yaitu rantai pendek. Struktur asam amino yang terdapat dalam protein ditemukan dalam bentuk ionik. Dimana struktur ke-20 asam amin dibagi menjadi 4 golongan yaitu : (1) golongan dengan gugus R non polar atau hidrofobik, (2) golongan dengan gugus R polar, tetapi tidak bermuatan, (3) golongan dengan gugus R bermuatan negatif, (4) golongan dengan gugus R bermuatan positif. Gugus R di dalam golongan ini merupakan hidrokarbon (Sumardjo, 2006).

Golongan Asam Amino mempunyai gugus polar tidak bermuatan. Gugus R dari asam amino polar lebih larut dalam air, atau lebih hidrofilik, dibandingkan dengan asam amino nonpolar, karena golongan ini mengandung gugus fungsionil ang membentuk ikatan hydrogen dengan air. Reaksi kimia asam amino mencirikan gugus fungsionil yang terkandung. Karena semua asam amino mengandung gugus amino dan karboksil, senyawa ini akan memberikan reaksi kimia yang mencirikan gugus-gugus ini. Contohnya gugus amino dapat memberikan reaksi asetilasi dan gugus karboksil esterifikasi (Sumardjo, 2006)

Gambar 1. Asam amino terionisasi membentuk ion dipolar (Zwitter ion)

Dalam Yanlinastuti & Syamsul (2016), di dalam larutan, asam amino terionisasi membentuk ion dipolar (Zwitter ion), Pada asam α-amino dengan gugus amino tunggal dan gugus karboksilat tunggal, ionisasinya menghasilkan bentuk dipolar dengan muatan listrik netral dan tidak bergerak di dalam medan listrik. Asam amino dalam bentuk ion dipolar dapat bersifat asam (donor proton) atau basa (akseptor proton) bergantung dengan siapa asam amino tersebut bereaksi. Sifat ini disebut sifat amfoter. Sifat asam amino sebagai asam dan basa dijelaskan pada gambar 2.

Gambar 2. Sifat amfoter asam amino. Asam amino dapat berperan sebagai asam (donor proton) dari gugus -NH₃⁺ dan bersifat basa (akseptor proton) dari gugus –COO.

Gugus amonium bersifat asam. Dalam reaksi dengan basa, gugus amonium dapat mendonorkan protonnya membentuk gugus amino. Sementara gugus karboksil bersifat basa. Reaksinya dengan asam membentuk gugus karboksilat. Sifat dipolar asam amino ditunjukkan oleh titik lebur kristal asam amino yang sangat tinggi seperti yang lazim ditunjukkan oleh senyawaan ionik lainnya. Kisi kristal asam amino dipertahankan oleh gaya tarik menarik elektrostatik antar muatan yang berlawanan. Karenanya dibutuhkan temperatur yang tinggi untuk melepaskan interaksi antar-ion ini agar kristal dapat melebur.

Fungsi utama protein makanan bagi tubuh adalah sebagai sumber asam-asam amino esensial yang akan digunakan untuk sintesis asam-asam amino non esenial dan sintesis protein didalam tubuh. Protein yang disintesis tubuh, mengganti bagian-bagian tubuh (sel dan jaringan tubuh) yang rusak, serta mempertahankan tubuh dari serangan mikrobia penyebab penyakit sebagai antibodi (Al Awwaly, 2017).

Telur merupakan salah satu sumber protein hewani yang dibutuhkan oleh tubuh, dan mengandung asam amino esensial yang lengkap. Telur banyak dikonsumsi oleh masyarakat karena mudah diolah, harganya murah, dan memiliki kandungan zat yang sempurna. Telur sebagai sumber protein mempunyai banyak keunggulan antara lain, mengandung asam amino paling lengkap dibandingkan bahan makanan lain seperti ikan, daging, ayam, tahu, tempe, dan lain-lain (Bakhtra, 2016)

Telur juga merupakan sumber mineral yang sangat istimewa dan lengkap yang terdiri dari zat besi, fosfor, kalsium, sodium, dan magnesium. Tinggi rendahnya masing-masing mineral dipengaruhi oleh pakan yang diberikan (Wirakusumah, 2005). Telur tersusun atas sebagian besar air (75% dari berat telur) dan bahan organik yaitu protein 12%, lipida 12%, vitamin dan karbohidrat 1%, sedangkan bahan anorganik yakni mineral. Telur tersusun atas tiga komponen utama, yaitu kuning telur (yolk), putih telur (albumen), kerabang telur, kerabang tipis dan bagian lain yang cukup kompleks. Sebutir telur dengan berat 60 gram mempunyai garis tengah (lingkar equator), 4,2 sampai 5,2 cm, dan lingkar membujur 13 sampai 16 cm. Isi telur berkisar 0,055 dan luas permukaan 70 cm². Rata-rata persentase berat kerabang 0,1%, kerabang tipis 0,4%, putih telur 61,5%, dan kuning telur 29%. Jika keseluruhan materi tersebut digabungkan, maka akan terbentuk 100% telur alami (Yuwanta, 2004).

Sedangkan menurut Rahayu (2003), putih telur atau albumen, seperti yang dinyatakan Yuwanta (2004), merupakan sumber protein telur (9,7 sampai 10,8%), selain itu juga mengandung fraksi gula (0,4 sampai 0,9%), dan garam mineral (0,5 sampai 0,6%), serta lemak (0,03%), abu (0,5 sampai 0,6%) dan berat kering dari putih telur berkisar antara (10,6 sampai 12,1%). Air merupakan komponen terbesar dari putih telur. Berat kering putih telur bervariasi tergantung dari strain, umur ayam, berat telur, dan lama penyimpanan telur. Kuning telur terdiri atas 85% lemak dan 15% protein. Lemak dari kuning telur terdiri atas 20% fosfolipid (licithinm serin, fosfatidil serin), 60% lemak netral (trigleserida) dan 5% kolestrol. Kadar kolestrol tergantung kepada umur dan varietas atau strain ayam, pengaruh konsumsi makanan dan suhu lingkungan. Strain ayam petelur putih menghasilkan kolesterol yang lebih tinggi dibandingkan dengan ayam petelur warna coklat. Ayam petelur putih menghasilkan telur dengan kadar kalesterol 17,41 mg per gram kuning telur.

Untuk menganalisis protein digunakan analaisis spektrofotometri. Menurut Yohan et al (2018), spektrofotometer UV- Vis merupakan salah satu instrumen yang digunakan untuk menguji sampel tertentu yang berorientasi pada analisis kualitatif dan kuantitatif pengukuran warnanya (colorimetry). Spektrum elektron suatu molekul adalah hasil transmisi antara dua tingkat energi elektron pada molekul tersebut (Creswell, 2005). Prinsip kerja spektrofotometer UV-Vis yaitu apabila cahaya monokromatik melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (I), sebagian dipantulkan (lr), dan sebagian lagi dipancarkan (It) (Yanlinastuti & Syamsul, 2016).

Alat bahan

Alat:

• Tabung reaksi 7 buah
• Labu takar 50 mL 1 buah
• Gelas kimia 25 mL 1 buah
• Gelas kimia 100 mL 2 buah
• Pipet tetes 4 buah
• Pengaduk 1 buah
• Pipet ukur 5 mL 1 buah
• Pipet ukur 1 mL 1 buah
• Ball pipette 1 buah
• Magnetic stirrer 1 buah
• Buret 1 buah
• pH meter 1 buah
• Tabung uji sentrifugal 3 buah
• Batang magnet 1 buah

Bahan:

• Larutan standar albumin 10 mg/mL
• Larutan NaOH 3%
• Reagen biuret
• Aquades
• Putih telur ayam
• Larutan asam amino 0,1 M
• Larutan NaOH 0,25 M
• Larutan HCl 1 M
• Larutan buffer pH 4, 7, 10
• Larutan glisin 0,1 M

Cara kerja

Penentuan kadar protein dengan Alat spektrofotometri UV-Vis

1. Pembuatan Sampel Putih Telur

• Putih telur ditimbang sebanyak 2 g
• Diencerkan dengan aquades, ditambah NaOH 3% 3-5 tetes
• Campuran diaduk, dituang ke labu takar 50 mL
• Ditambah aquuades sampai batas, kemudian dikocok

2. Pembuatan Larutan Standar Protein

• 5 tabung reaksi diisi larutan standar albumin 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mL
• Ditambah aquades sampai 1 mL
• 1 tabung kosong diisi sampel 1 mL
• Keenamnya diisi reagen biuret 4 mL dan 1 tabung kosong diisi 8 mL
• Didiamkan 30 menit
• Diuji dengan spektrofotometer UV-Vis pada λ 540 nm

Sifat Asam Basa Asam Amino

1. Kalibrasi pH Meter

• Tutup elektroda pH meter dilepas
• Dicuci dengan aquades kemudian di lap dengan tisu
• Elektroda dicelupkan pada buffer pH 4
• Di klik Cal, ditunggu sampai pH stabil
• Elektroda dicuci dengan aquades
• Kalibrasi diulangi pada pH 7 dan 10

2. Titrasi Asam Amino

• Gelas kimia diisi 20 mL larutan glisin 0,1 M
• Alat magnetic stirer diset beserta buretnya
• Larutan ditambah HCl sampai pH 2
• Larutan dititrasi dengan NaOH sampaii pH 12

Data pengamatan

1. Penentuan kadar protein dengan Alat spektrofotometri UV-Vis

Konsentrasi Larutan Blanko, Standar dan Sampel pada Panjang Gelombang 540 nm

Larutan	Konsentrasi (mg/ml)	Absorbansi (A)
Blanko	0	0
Standar	0,2	0,199
	0,4	0,374
	0,6	0,542
	0,8	0,624
	1	0,685
Sampel	Pengulangan	Absorbansi
Putih telur	1	0,145
	2	0,143
	3	0,147

2. Sifat asam basa asam amino

Data 1 (pH larutan terhadap penambahan HCl)

Tetesan Ke-	Volume HCl (ml)	pH
0	0	5
1	0,5	4
2	1,0	3
3	1,5	3
4	2,0	3
5	2,5	3
6	3,0	3
7	3,5	3
8	4,0	2

Data 2 (pH larutan terhadap penambahan NaOH)

Tetesan Ke-	Volume HCl (ml)	pH
0	0	5
1	0,2	8
2	0,4	9
3	0,6	9
4	0,8	10
5	1	10
6	1,2	10
7	1,4	11
8	1,6	11
9	1,8	11
10	2	11
11	2,2	11
12	2,4	11
13	2,6	11
14	2,8	11
15	3	11
16	3,2	11
17	3,4	12

Analisis Data

1. Penentuan Kadar Protein Secara Spektrofotometri

Kurva kalibrasi standar

Perhitungan konsentrasi protein dalam sampel

Absorbansi (y) = 0,145 A y = 0,6954x + 0,0563 0,145 = 0,6954x + 0,0563 0,06954x = 0,145 – 0,0563 x = 1,27	X rata – rata = (x1 + x2 + x2)/3 = (1,27 + 1,24 + 1,27)/3 = 1,26 Jadi, konsentrasi protein putih telur yaitu 1,26 mg/100ml M1 X 1 ml = 1,26 mg/ml X 50 ml Kadar protein = x X faktor pengenceran = 1,26 X 50 kali = 63 mg/100ml Jadi, kadar protein kuning telur rebus 63 mg/100ml
Absorbansi (y) = 0,143 A y = 0,6954x + 0,0563 0,143 = 0,6954x + 0,0563 0,06954x = 0,143 – 0,0563 x = 1,24
Absorbansi (y) = 0,147 A y = 0,6954x + 0,0563 0,145 = 0,6954x + 0,0563 0,06954x = 0,145 – 0,0563 x = 1,27

2. Sifat Asam Basa Amino

Grafik Hubungan antara Volume HCl terhadap pH Larutan Glisin

Berdasarkan grafik titrasi glisin dan HCl 0,1 M dapat ditentukan pK gugus amino sebagai berikut :

Persamaan garis,

y = -0.25x + 4.4722

y = – 0.25(2,0) + 4.4722

y = -0,5 + 4.4722

y= 3.9722

Maka, pKa gugus amino dalam percobaan ini adalah 3.9722

Grafik Hubungan antara Volume NaOH terhadap pH Larutan Glisin

Berdasarkan grafik titrasi glisin dan NaOH 0,25 M dapat ditentukan pK gugus amino sebagai berikut :

Volume NaOH keseluruhan yang terpakai adalah 5,0 mL

x = 3,4 :2

x = 1,7

Persamaan garis,

y = 0.2405x + 7.8824

y = 0.2405(1,7) + 7.8824

y = 0,40885 + 7,8824

y = 8,29125

Maka, pKb gugus asam karboksilat dalam percobaan ini adalah 8,29125

Dari dua data( kurva glisin + HCl dan glisin + NaOH) dapat ditentukan pH saat titik isoelektrik (pHI). pH isoelektrik yang diperoleh dapat dihitung sebagai berikut :

pH I = 0,5 ( pK amino + pK asam karboksilat)

pH I = 0,5 (3.9722 + 8,29125)

pH I = 0.5 (12,26345)

pH I = 6,131725

Jadi, pH isoelektrik tercapai pada pH 6,131725 atau 6,13

Pembahasan

Penentuan Kadar Protein Secara Spektrofotometri

Pada percobaan ini dilakukan untuk menentukan kadar protein pada putih telur menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis. Protein yang terdapat dalam makanan berfungsi sebagai zat utama dalam pembentukan dan pertumbuhan tubuh. Dalam bahan pangan, protein digolongkan menjadi protein globular, protein serat (fibrous), dan protein konjugasi. Protein globular umumnya mempunyai sifat dapat larut dalam air, dalam larutan asam dan basa dan etanol. Salah satu protein globular adalah albumin yang banyak terdapat dalam telur. Analisis protein dalam bahan pangan dapat dilakukan dengan dua metode yaitu metode kuantitatif dan kualitatif. Analisis kualitatif ini biasanya dapat dilakukan dengan reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi Sakaguchi. Sedangkan analisis kuantitatif dapat dilakukan dengan metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode lowry, dan metode spektrofotometri visible (Biuret). Pada percobaan ini akan dilakukan analisis protein kuantitatif dengan metode biuret menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis. Prinsip dari metode ini yaitu pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks berwarna ungu yang terjadi bila protein bereaksi dengan ion Cu²⁺ dalam suasana basa.

Sebelum penentuan kadar protein dalam telur, langkah pertama yang dilakukan yaitu menyiapkan sampel. Sampel yang akan digunakan adalah putih telur yang ditimbang sebesar 2 gram yang kemudian ditetesi dengan NaOH 3% sebanyak 3-5 tetes. Penambahan NaOH dilakukan untuk memberikan suasana basa pada sampel yang menyebabkan terjadinya hidrolisis ikatan peptida dari polimer protein. Sampel kemudian diencerkan ke dalam labu takar 50 mL. Selanjutnya yang dilakukan yaitu pembuatan larutan standar protein. Larutan standar yang digunakan yaitu albumin 10 mg/mL. Disiapkan 5 tabung yang diisi dengan albumin sebagai larutan standar dengan masing-masing tabung diisi sebanyak 0,2;0,4;0,6;0,8;1 mL. Larutan standar tersebut diencerkan dengan air sampai 1 mL. Selain larutan standar, disiapkan pula 2 tabung reaksi yang berisi larutan blanko dan larutan sampel yang sudah disiapkan sebelumnya sebanyak 1 mL.

Masing-masing tabung reaksi yang berisi larutan blanko, larutan standar, dan larutan sampel ditambah dengan reagen biuret. Pada larutan blanko ditambahkan sebanyak 8 mL reagen biuret, sedangkan pada larutan standar dan sampel ditambahkan dengan reagen biuret sebanyak 4 mL. Larutan yang telah ditambah dengan reagen biuret berubah warna menjadi warna ungu. Warna ungu tersebut terjadi karena Cu²⁺ membentuk kompleks dengan ikatan peptida pada suatu protein. Terjadinya warna ungu terbentuk dari ikatan antara Cu dan N, unsur N terdapat pada peptida menghasilkan CuN yang terjadi dalam suasana basa. Semakin panjang suatu ikatan peptida, maka warna ungu yang terbentuk semakin jelas dan makin pekat. Reaksi yang terjadi pada penetapan kadar protein secara Biuret adalah:

Setelah semua larutan ditambahkan dengan reagen biuret, larutan didiamkan selama 30 menit. Waktu 30 menit ini merupakan OT (operating time), yaitu waktu yang dibutuhkan agar seluruh reaktan/protein bereaksi seluruhnya dengan reagen. Setelah 30 menit, selanjutnya dilakukan pengukuran larutan standar untuk pembuatan kurva kalibrasi menggunakan spektrofotometer UV-Vis dengan panjang gelombang 540 nm. Penggunaan panjang gelombang 540 nm ini dikarenakan sesuai dengan kompleks protein. Selanjutnya memasukkan larutan blanko untuk mengkalibrasi spektrofotometer UV-Vis. Kemudian diukur pula larutan sampel ke dalam spektrofotometer UV-Vis untuk mengukur absorbansi larutan, sehingga setiap melakukan pengujian absorbansi sampel dan diperoleh absorbansinya, maka dilakukan pengkalibrasian dengan larutan blanko.

Setelah didapatkan absorbansi dari pengukuran larutan standar dan larutan sampel, maka langkah selanjutnya yaitu membuat kurva standar. Kurva standar dibuat dari hubungan antara konsentrasi larutan dengan absorbansinya. Kurva standar dibuat dari larutan standar. Larutan standar adalah larutan yang sudah diketahui nilai konsentrasinya. Kurva standar yang didapatkan pada percobaan ini adalah sebagai berikut:

Dalam kurva tersebut, apabila nilai kadar protein meningkat maka absorbansinya juga akan meningkat. Kurva standar tersebut diperlukan untuk menghitung nilai konsentrasi sampel protein yang diukur menggunakan persamaan garis dari larutan standar yang diperoleh. Dari kurva standar diperoleh persamaan garis lurus untuk menentukan konsentrasi sampel sebagai berikut:

y = 0,6954x + 0,0563

Absorbansi sampel yang diperoleh disubstitusikan dalam persamaan tersebut sehingga diperoleh hasil konsentrasi sampel, selanjutnya dapat diukur kadar protein sampel. Berdasarkan hasil perhitungan dalam analisis data diperoleh hasil konsentrasi sampel protein yaitu sebesar 1,26 mg/mL dan kadar proteinnya yaitu sebesar 63 mg/mL.

Sifat Asam Basa Amino

Pada percobaan ini dilakukan pengukuran pH terhadap asam amino yaitu asam amino glisin, dengan menggunakan titran larutan NaOH 0,25 M dan larutan HCl 0.1 M. Asam amino dalam keadaan pH tertentu dapat berubah sifat keasaman dan kebasaannya maka pada keadaan tersebut kebasaan keasaman dari asam amino dapat ditentukan berdasarkan titrasi asam amino. Penambahan asam klorida yang bersifat asam kuat mengakibatkan adanya ion H⁺ yang berlebih, dimana terjadi penurunan pH setiap penambahan 0,5 ml larutan titran. Penambahan natrium hidroksida yang bersifat basa kuat mengakibatkan adanya ion OH^– yang berlebih, dimana terjadi penambahan pH setiap penambahan 0,2 ml larutan titran. pH awal glisin sebelum dititrasi oleh asam klorida dan natrium hidroksida adalah 5.

Sebelum dilakukan pengukuran pH terhadap asam amino dilakukan kalibrasi pH meter terlebih dahulu.pH meter yang digunakan harus dikalibrasi terlebih dahulu dengan menggunakan larutan dengan pH tertentu sebagai buffer. Pengkalibrasiannya dilakukan dengan menggunakan larutan buffer pH 4, buffer pH 7, dan buffer pH 10. Tujuan dari proses kalibrasi adalah untuk menetapkan apakah kondisi pH meter masih dapat digunakan dan memastikan bahwa pH meter memberikan hasil analisa yang akurat dan presisi. Kalibrasi bermanfaat untuk menjaga alat ukur dengan bahan yang akan diukur tetap sesuai dengan spesifikasinya. Dalam melakukan kalibrasi pH meter sangat direkomendasi menggunakan buffer dimana rentang pengukuran tercakup di dalamnya. Pada percobaan kali ini menggunakan sampel asam dan basa sehingga menggunakan larutan buffer dengan pH 4, 7, atau 10. Sebelum dikalibrasi elektroda harus dibilas terlebih dahulu dengan aquades dan dilap dengan tisu sampai kering baru dimasukkan kedalam larutan buffer pH 4. Saat dilap dengan tisu berfungsi agar larutan yang menempel pada elektroda tidak mempengaruhi pH larutan yang akan ditentukan. Setelah dicelupkan pada larutan buffer lihat pada layar apakah pH sudah sesuai dengan keadaan sebenarnya, jika sudah sesuai dengan pH yang sebenarnya dilanjutkan ke pH 7 dan 10 dengan perlakuan yang sama. Setelah selesai berarti alat pH meter sudah bisa dipakai untuk menentukan pH larutan lainnya. Bila tidak terbaca atau error berarti elektroda tidak kering dari larutan sebelumnya.

Glisin adalah asam amino paling sederhana dengan rumus kimia C₂H₅NO₂. Rumus struktur glisin adalah:

Glisin memiliki gugus karboksilat (-COOH) dan gugus amina (-NH₂) sehingga dapat membentuk zwitter ion atau ion dipolar, yang apabila dalam larutan dapat membentuk ion karboksilat (-COO-) dan ion amonium (-NH³⁺) dalam sebuah molekul glisin dengan melepaskan proton dari masing-masing gugus, strukturnya:

Glisin bersifat amfoter, yakni dapat bereaksi dengan asam maupun dengan basa. Persamaan reaksi yang terjadi saat titrasi glisin dalam suasana asam:

Pada percobaan pertama larutan glisin 10 ml diletakkan di enlenmeyer dan dititrasi dengan penambahan larutan HCl 0,5 ml secara periodik sampai pH larutan glisin mencapai pH 2, dan dicatat pH larutan glisin setiap penambahan 0,5 ml HCl sampai pH 2. Pada percobaan, kita membutuhkan 8 kali penambahan larutan HCl 0,5 ml (total larutan HCl yang dibutuhkan adalah 4 ml) sehingga memperoleh pH 2 . Berikut adalah grafik antara volume HCl terhadap ph larutan glisin.

Berdasarkan grafik tersebut diperoleh persamaan regresi linier y = -0.25x + 4.4722, setelah diperoleh persamaan tersebut didapatkan pKa gugus amino dalam percobaan ini adalah 3.9722. Keadaan glisin bentuk ion dalam bentuk larutan. Larutan yang dititrasi dengan asam kuat akan mengakibatkan meningkatnya konsentrasi ion H⁺. Oleh karena itu, ketika larutan glisin dititrasi dengan HCl maka dapat membentuk suatu kation. Ion H⁺ dari asam akan diikat oleh gugus karboksil yang bermuatan negatif sehingga molekul glisin yang semula berupa zwitter ion setelah menangkap ion H⁺ hanya akan bermuatan positif saja yang berupa suatu kation. Ketika terjadi penambahan ion H⁺ pada larutan glisin akan mengakibatkan konsentrasi ion H⁺ yang tinggi sehingga mampu berikatan dengan ion –COO dan terbentuk gugus –COOH dan dengan demikian glisin terdapat dalam bentuk kationnya saja. Titrasi berakhir pada pH=2 saat semua glisin dalam bentuk positif sebagai kation yang bersifat asam.

Selain penambahan larutan HCl, pH larutan glisin juga diuji dengan larutan NaOH. Pengujian pH larutan ditambahkan NaOh setiap periodiknya, yaitu 0,2 ml. mulanya, diambil larutan glisin 10 ml diletakkan di erlenmeyer dan dititrasi dengan penambahan larutan NaOH 0,2 ml secara periodik sampai pH larutan glisin mencapai pH 12, dicatat pH larutan glisin setiap penambahan 0,2 ml NaOH sampai pH 12. Pada percobaan membutuhkan 17 kali penambahan larutan NaOH 0,2 ml (total larutan NaOH yang dibutuhkan adalah 3,4 ml) sehingga memperoleh pH 12. Berikut adalah grafik antara volume NaOH terhadap pH larutan glisin. Grafik Hubungan antara Volume NaOH terhadap pH Larutan Glisin

Berdasarkan grafik tersebut diperoleh persamaan regresi linier y = -0.25x + 4.4722, setelah diperoleh persamaan tersebut didapatkan pKb gugus asam karboksilat sebesar 8,29125. Glisin yang ditambahkan dengan NaOH akan terdapat dalam bentuk anionnya karena konsentrasi OH^– yang tinggi. Oleh karena itu, ketika pada larutan glisin terjadi penambahan ion OH^– maka dapat membentuk suatu anion. Ion OH^– dari basa akan menarik sebuah ion H⁺ dari gugus –NH sehingga molekul glisin yang semula berupa zwitter ion setelah melepaskan sebuah ion H⁺ hanya akan bermuatan negatif saja yang berupa anion. Glisin yang ditambahkan basa, maka akan terdapat dalam bentuk anionnya karena ion OH^– yang tinggi mampu mengikat ion-ion H⁺ yang terdapat pada gugus –NH membentuk gugus NH₂ dan H₂O. Jadi, larutan glisin mengalami keseimbangan sebagai berikut : dalam suasana asam (pH rendah) ion dipol glisin mengikat ion H⁺ membentuk kation sehingga ion amfoter glisin bersifat basa sedangkan dalam suasana basa (pH tinggi) mengikat OH^– menghasilkan anion dan ion dipol glisin bersifat asam. Bila dibandingkan antara titrasi ketika terjadi penambahan H⁺ dan ketika terjadi penambahan OH^–, maka ketika terjadi penambahan OH^– lebih cepat dalam memberikan perubahan pH sehingga jumlah OH^– yang diperlukan lebih sedikit. Hal ini disebabkan oleh ion OH^– yang tinggi mampu mengikat ion-ion H⁺ yang terdapat pada gugus – NH₃⁺, membentuk gugus NH₂ dan H₂O. Titik isoelektrik dapat ditetapkan dengan titrasi. Titrasi kation dari glisin N₃H⁺CH₂CO₂H dengan basa, ketika basa ditambahkan, ion yang terprotonkan sempurna diubah menjadi ion dipolar yang netral, N₃H⁺-CH₂CO₂-. Ketika lebih banyak basa ditambahkan, semua bentuk kation diubah menjadi ion dipolar yang netral. pH pada saat terjadinya hal ini adalah titik isoelektrik.

Dari literatur diketahui tetapan isoelektriknya adalah 6,06. Sedangkan harga titik isoelektrik hasil percobaan dari hasil perhitungan didapatkan sebesar 6,13. Jadi, hasil perhitungan harga titik isolistrik dibandingkan dengan di literatur berbeda sedikit dengan selisih 0.07. Pada titrasi glisin dengan HCl 0,1 N dan dengan NaOH 0,25 M kurva antara pH dan volume (tetes) pada hasil percobaan, memberikan bentuk kurva yang hampir sama dengan literatur.

Simpulan

Prinsip dari metode biuret menguunakan alat spektrofotometer dalam analisis kuantitatif protein putih telur yaitu pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks berwarna ungu yang terjadi bila protein bereaksi dengan ion Cu²⁺ dalam suasana basa. Warna ungu tersebut terjadi karena Cu²⁺ membentuk kompleks dengan ikatan peptida pada suatu protein. Terjadinya warna ungu terbentuk dari ikatan antara Cu dan N, unsur N terdapat pada peptida menghasilkan CuN yang terjadi dalam suasana basa. Semakin panjang suatu ikatan peptida, maka warna ungu yang terbentuk semakin jelas dan makin pekat. Pada percobaan penentuan kadar protein yang telah dilakukan, didapatkan hasil konsentrasi sampel protein yaitu sebesar 1,26 mg/mL dan kadar proteinnya yaitu sebesar 63 mg/mL.

Asam amino dalam keadaan pH tertentu dapat berubah sifat keasaman dan kebasaannya maka pada keadaan tersebut kebasaan keasaman dari asam amino dapat ditentukan berdasarkan titrasi asam amino. Berdasarkan percobaan titrasi asam amino yang berupa glisin, didapatkan harga titik isoelektrik sebesar 6,13. Berdasarkan literatur diketahui tetapan isoelektriknya adalah 6,06. Jadi, hasil perhitungan harga titik isolistrik dibandingkan dengan di literatur berbeda sedikit dengan selisih 0.07. Pada titrasi glisin dengan HCl 0,1 N dan dengan NaOH 0,25 M kurva antara pH dan volume (tetes) pada hasil percobaan, memberikan bentuk kurva yang hampir sama dengan literatur

Daftar Pustaka

Al Awwaly, Khotibul Uma. (2017). Protein Pangan Hasil Ternak dan Aplikasinya. Malang : UB Press

Bakhtra, D., D.A, dkk. (2016). Penetapan Kadar Protein dalam Telur Unggas Melalui Analisis Nitrogen Menggunakan Metode Kjeldahl. Jurnal Farmasi Higea. 8(2) : 144

Cresswell, Clifford.J. (2005). Analisis Spektrum Senyawa Organik. Bandung: ITB

Mandle, A.K., Pranita J., & Shailendra K.S. (2012). Protein Structure Prediction Using Support Vector Machine, International Journal on oft Computing (IJSC), 3(1)

Rahayu, Imam. (2003). Karakteristik Fisik, Komposisi Kimia dan Uji Organoleptik Telur Ayam Merawang Dengan Pemberian Pakan Bersuplemen Omega-3, Jurnal Teknologi dan Industri Pangan, 14(3) : 199-205

Simarora, Adelina. (2015). Asam Amino, Protein, dan Protein. Jakarta : FK Ukrida

Sumardjo, Damin. (2006). Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran dan Program Strata 1 Bioeksata. Jakarta : Buku Kedokteran EGC

Wirakusumah, E. S. (2005). Menikmati Telur. Jakarta : PT Gramedia Pustaka Utama.

Yanlinastuti & Syamsul Fatimah. (2016). Pengaruh Konsentrasi Pelarut untuk Menentukan Kadar Zirkonium dalam Paduan U-Zr dengan Menggunakan Metode Spektrofotometri UV-Vis, Jurnal BATAN, No.17/IX : 22-33

Yohan, Fifit A, & Adimas W. (2018). Pembuatan Spektrofotometer Edukasi Untuk Analisis Senyawa Pewarna Makanan, Chimica et Natura Acta, 6(3) : 111-115

Yuwanta, T. (2004). Telur dan Kualitas Telur. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Evaluasi

1. Jelaskan hukum yang mendasari analisis mengunakan alat spektrofotometri.

Jawab:

Prinsip alat ini berdasarkan hukum Lambert Beer bila cahaya monokromatik bila (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It). Transmitan adalah perbandingan intensitas cahaya yang ditransmisikan ketika melewati sampel (It) dengan intensitas cahaya mula-mula sebelum melewati sampel (Io).

2. Gambarkan bagan cara kerja instrumen spektrofotometri sinar tampak.

Jawab:

3. Jelaskan kelebihan dan kelemahan penggunaan cara Biuret dengan spektronik 20 untuk analisis kadar protein.

Jawab:

• Kelebihan yang diperoleh dengan menggunakan metode biuret ini adalah reagen yang digunakan hanya satu macam berbeda dengan metode Lowry yang menggunakan empat macam reagen
• Kelemahan menggunakan metode ini adalah hasil yang ditunjukan belum tentu murni merupakan protein, melainkan dapat berupa kadar senyawa yang mengandung benzena, gugus fenol, atau gugus sulfihidrin juga ikut terbaca kadarnya. Selain itu waktu yang digunakan untuk pengukuran absorbansinya tergolong lama karena harus melakukan proses pemanasan sapel dengan penangas terlebih dahulu sehingga dirasa kurang efisien.

4. Mengapa pada reaksi pada percobaan ini disebut reaksi biuret?

Jawab:

Karena larutan sampel protein yang digunakan tanpa penambahan akuades, hanya menggunakan sampel protein dengan reagen biuret saja. Prinsipnya adalah bahwa ikatan peptida dapat membentuk senyawa kompleks berwarna ungu dengan penambahan garam kupri dalam suasana basa.