Prinsip Kerja
Kromatografi pada hakekatnya merupakan metode pemisahan dimana komponen yang akan dipisahkan terdistribusi diantara dua fase yang saling tidak bercampur yaitu fasa diam dan fasa gerak. Kromatografi juga didefinisikan sebagai proses pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diffferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan tekanan uapnya (Bahti, 1998).
Pada dasarnya prinsip kerja HPLC sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom, yang membedakan adalah fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien. Pada HPLC tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak dapat bergerak lebih cepat sehingga difusi menjadi sekecil-kecilnya. Ukuran butir kecil pada fasa diam dan tekanan yang tinggi pada fasa gerak pada kromatografi kolom cair secara teori akan menghasilkan pemisahan yang sebaik-baiknya.
Bagian-Bagian HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
a) Wadah fase gerak dan fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikelpartikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan (degassing), sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, buffer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi. Adanya pengotor dapat mengganggu sistem kromatografi. Fungsi fase gerak adalah membawa komponen campuran menuju detector (Gandjar dan Rohman, 2007).
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik (Gandjar dann Rohman, 2007).
Proses elusi ada 2 macam, yaitu isocratic elution (solvent tunggal dengan komposisi tetap dan gradient elution (digunakan 2 atau lebih solvent dengan polaritas yang berbeda).
b) Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit.
Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan (Gandjar dann Rohman, 2007).
Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
C) Injektor
Cuplikan harus dimasukan kedalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada dua ragam utama aliran henti dan pelarut mengalir. Ada 3 macam system injector, yaitu:
- Stop flow: aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, system tertutup dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.
- Septum: septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injector ini dapat digunakan pada kinerja sampa 60 – 70 atmosfir. Tapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injector) dapat menyebabkan penyumbatan.
- Loop vaive: tipe injector ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10µ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi load, sampel diisikan ke dalam loop pada kinerja atmosfir, bila valve difungsikan, maka sampel akan masuk dalam kolom.
d) Kolom
Kolom kromatografi cair biasanya dibangun dari yang halus atau stainless steel. Kolom HPLC kadang-kadang dibuat dari tabung gelas dan tabung polimer, seperti polyetheretherketone. Selain dilapisi baja, kolom juga dapat dilapisi stainless. Kolom dapat dibagi menjadi kolom analitik dan kolom pengaman. Kolom kromatogram yang biasa digunakan adalah jenis C-18 yang digunakan sebagai fase diam yang mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, dan tinggi. Sedangkan kolom pengaman untuk menyaring kotoran dan menjenuhkan fase diam.
e) Detektor
Detector diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam eluen kolom dan mengatur jumlahnya. Detector yang baik sangat peka, tidak banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar dan menggapai semua jenis senyawa. Jenis-jenis detektor: UV/Vis, Retraktif indeks (RI) detector, Konduktifitas decetor, Elektroimia detector, PDA, ELSD dan MS dectetor
Cara Kerja HPLC
Mula-mula solven diambil melalui pompa. Solven ini dikemudian masuk ke dalam katup injeksi berputar, yang dipasang tepat pada sampel loop. Dengan pertolongan mikrosiring, sampel dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan solven masuk ke dalam kolom. Hasil pemisahan dideteksi oleh detector, yang penampakannya ditunjukan oleh perekam (pencatat = recorder). Tekanan solven di atur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa pemasuk solven pada tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah, yakni beberapa milliliter per menit. Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampel. Tahap pemekatan dengan ekstraksi solven dan penguapan untuk memperkecil volum sering kali diperlukan sebelum pengerjaan sampel dengan HPLC. Hal ini terutama sering dilakukan untuk analisis senyawa-senyawa hidrokarbon aromatic polisiklik (PAH) atau residu pestisida dalam makanan.
Kelebihan HPLC
Dibandingkan dengan kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC High Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan. Beberapa kelebihan KCKT diantaranya ialah:
- Dapat dilaksanakan pada suhu kamar.
- Cepat dan mudah melaksanakannya.
- Detektor HPLC dapat divariasi dan unik.
- Pelarut pengembang bisa dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya.
- Ideal untuk molekul besar dan ion.
- Mudah memperoleh cuplikan.
- Daya pisahnya baik
- Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang di analisis.
- HPLC juga dapat menganalisis senyawa yang tidak mudah menguap dan termolabil.
Aplikasi HPLC
Zat-zat yang dapat dianalisis seperti asam amino, protein, hidrokarbon, asam nukleat, karbohidrat, senyawa obat, terpenoid, pestisida, antibiotik, steroid, organologam, dll. HPLC juga cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna untuk memisahkan campuran rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-komponennya. HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi, segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula. HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spekrum UV atau spectrum sinar tampak. Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori (lebih dari 100.000 untuk kolom 100 cm), dan kromatografi dilakukan dalam kondisi mendekati kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat diperoleh dalam beberapa menit dan ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan.
Kesimpulan
HPLC memiliki prinsip kerja seperti kromatografi kolom. Fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien. Pada HPLC tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak dapat bergerak lebih cepat.
Instrumentasi HPLC meliputi wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, suatu komputer atau integrator atau perekam.
Referensi
Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Bandung: Universitas Padjajaran
Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar
