Pendahuluan
Kromatografi cair pertama kali diperkenalkan oleh Tswett pada tahun 1903 yang menggunakan kolom kapur untuk memisahkan pigmen dari daun daun hijau. Kata kromatografi berasal dari kata Jerman chromos berarti warna dan grafik berarti menulis Martin dan Synge tahun 1941 memperkenalkan kromatografi cair-cair dan secara umum mengatur perkembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan karya pertama mereka tentang kromatografi gas. Pada 1952 sampai akhir 1960 kromatografi gas berkembang dan menjadi Era penting perkembangan kromatografi. pada akhir tahun 1960-an teknologi untuk menghasilkan kemasan dengan partikel berdiameter 3 sampai 10 um telah berkembang kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT/HPLC) atau high performance Liquid chromatography berkembang dari usaha tersebut. sekarang kromatografi cair kinerja tinggi merupakan teknik pemisahan yang lebih baik di mana banyak keputusan telah dibuat dan aplikasi jauh lebih banyak dibanding dengan kromatografi gas (Dachriyanus, 2017).
Kromatografi pada hakekatnya merupakan metode pemisahan dimana komponen yang akan dipisahkan terdistribusi diantara dua fase yang saling tidak bercampur yaitu fasa diam dan fasa gerak. Kromatografi juga didefinisikan sebagai proses pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diffferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan tekanan uapnya (Bahti, 1998).
Kromatografi cair kolom klasik merupakan prosedur pemisahan dimana fase cair yang mengalir perlahan-lahan melewati kolom akibat gaya gravitasi dan terjadi proses pemisahan di kolom tersebut. Metode itu dicirikan dengan efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cair kembali dilirik dengan dikembangkannya sistem kolom bertekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang mampu bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 nm dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cair yang biasa. (Bassett et. all., 1994). Dengan kelebihan dari kromatografi cair bertekanan tinggi ini, maka disebut sebagai kromatografi cair kinerja tinggi (High Performance Liquid Chromatografi).
KCKT lebih dipilih untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap keunggulan metode ini dibanding metode pemisahan lainnya terletak pada ketepatan analisis dan kepekaan yang tinggi serta cocok untuk memisahkan senyawa senyawa non volatil yang tidak tahan pemanasan. Kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan adanya berbagai Sistem deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan sistem kromatografinya (Dachriyanus, 2017).
Analisis HPLC
HPLC merupakan hubungan antara waktu sebagai absis dan tanggap detektor sebagai ordinat pada sistem koordinat kartesian di mana titik nol dinyatakan sebagai saat dimulainya injeksi sampel. molekul analit akan keluar dari kolom secara acak dan demikian pula respon detektor terhadap analit yang keluar dari kolam tersebut tidak serempak terhadap semua molekul sebagai akibat kenyataan tersebut maka profil kromatogram akan melebar secara ideal membentuk kurva Gauss (Dachriyanus, 2017).
Waktu Retensi
Waktu retensi atau waktu tambat retention Time selang waktu yang diperlukan oleh analis mulai saat injeksi sampai keluar dari kolom dan sinyalnya secara maksimal ditangkap oleh detektor disebut sebagai waktu retensi atau retention time atau waktu tambahan waktu retensi analit yang tertahan pada fase diam dinyatakan dengan tR sedangkan waktu retensi analit yang tidak tertahan pada fase diam atau sering disebut dengan waktu retensi pelarut pengelusi dinyatakan sebagai to atau tM.
to = Waktu retensi pelarut pengelusi; tR1 & tR2 = Waktu Retensi analit 1 dan analit 2
Waktu retensi analit dikurangi dengan waktu retensi pelarut pengelusi atau pelarut dicampur disebut sebagai waktu retensi terkoreksi yang dinyatakan dengan tR’. tR’=tR-to Waktu retensi yang dinyatakan dalam satuan menit memberikan arti yang sangat penting dalam analisa kualitatif dengan HPLC (Dachriyanus, 2017).
Faktor Kapasitas atau Faktor Retensi
Faktor kapasitas atau faktor retensi merupakan ciri khas suatu analisis pada kondisi tertentu yaitu pada komposisi fase gerak suhu dan jenis kolom (panjang kolom, di ketebalan lapisan film) tertentu. Meskipun suatu Puncak kromatogram dapat diidentifikasi melalui waktu retensinya namun akan lebih baik bila diidentifikasi dengan menggunakan faktor kapasitas karena harga waktu retensi dapat berubah-ubah sesuai dengan panjang kolom dan kecepatan alir fase gerak nya. Faktor kapasitas dapat memberikan gambaran dimana puncak-puncak analit terelusi secara relatif terhadap Puncak fase geraknya. faktor kapasitas k’dinyatakan sebagai berikut:
k’ = tR-to/to
dimana tR-to adalah waktu retensi terkoreksi dan to adalah waktu retensi fase gerak.
Harga faktor kapasitas k’ yang baik adalah berkisar antara 2 dan 10. Bila harga k’ kecil berarti analit ditahan sedikit oleh kolom dan terelusi dekat dengan puncak fase gerak. Ini menghasilkan pemisahan yang kurang bagus. Harga k’ yang besar (misalnya 20-30 menit) menunjukkan pemisahan yang baik tetapi menyebabkan waktu analisis terlalu lama (Dachriyanus, 2017).
Selektivitas (alpa)
Kemampuan fase diam untuk memisahkan dua komponen, dimana komponen 2 sangat tertahan dibandingkan komponen 1 ditentukan oleh partisi atau rasio relatifnya sehingga tergantung pada faktor kapasitasnya pada fase diam tertentu selektivitas (alpa) merupakan nilai retensi relatif setiap komponen oleh fase diam
Selektivitas untuk pasangan Puncak yang bersebelahan merupakan fungsi jenis fase diam yang digunakan fase gerak dan suhu kolom dan harus dioptimasi terutama untuk Komponen yang paling sukar terpisah selama elusi supaya pemisahan terjadi maka nilai selektivitas harus lebih besar dari 1 (Dachriyanus, 2017).
Efesiensi Kolom
Terdapat dua cara yang paling lazim digunakan dalam mengukur efisiensi kolom kromatografi yaitu jumlah plat teori (N) dan jarak setara pelat teori (JSPT)
1. Jumlah Plat Teori (N)
Banyaknya distribusi keseimbangan dinamis yang terjadi di dalam suatu kolom. sebuah plat RI digunakan untuk mengetahui keefisienan kolom.
2. Jarak Setara Plat Teori (JSPT)
JSPT atau TSPT secara internasional dikenal dengan (high equivalent of theoretical plate) merupakan panjang kolom kromatografi (mm) yang diperlukan sampai terjadinya satu kali keseimbangan distribusi dinamis molekul analit dalam fase gerak dan fase diam harga berkaitan dengan jumlah plat teori menurut persamaan:
Kolom untuk kromatografi cair berkecepatan tinggi biasanya mempunyai tinggi pelat rentan 0,01 sampai 1,0 mm (Dachriyanus, 2017).
Resolusi
Tujuan kromatografi ialah memisahkan komponen cuplikan dalam waktu yang masuk akal menjadi pita atau puncak ketika cuplikan itu bergerak melalui kolom. Daya pisah R antara dua puncak dapat diukur secara kuantitatif sebagai berikut:
Pemisahan dua Puncak dengan R lebih dari = 1,5 merupakan harga resolusi ideal gimana dua Puncak terpisah secara sempurna bila pada suatu analisis diperoleh R kurang dari 1,5 maka untuk meningkatkan harga Rolex fase diam dapat dilakukan dengan menggunakan kolom yang lebih panjang sehingga menambah jumlah plat teoritis (Dachriyanus, 2017).
Faktor Simetri
Faktor simetri atau tailing faktor yaitu terjadi pengapuran pada kromatogram sehingga bentuk kromatogram menjadi tidak simetris
Referensi
Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Bandung: Universitas Padjajaran. Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif
Anorganik. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Dachriyanus, Meri Susanti. 2017. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Padang: LPTIK Universitas Andalas
